Chiết xuất, phân lập và tinh chế Nuciferin từ lá Sen

1. Chiết xuất alcaloid toàn phần từ lá cây Sen

  Chuẩn bị nguyên liệu: Lá sen phơi khô, thái nhỏ, sấy khô ở 60oC trong tủ sấy, tán nhỏ thành bột dược liệu bằng thuyền tán rồi tiến hành chiết xuất theo hai qui trình khác nhau:

™ Chiết nóng: 

Cân chính xác khoảng 70,00 g bột lá sen, làm  ẩm bằng NH4OH 10%.

Chiết nóng bằng đun hồi lưu sôi với ethanol 96o

(khoảng 500 ml). Cất thu hồi

cồn, hòa tan cắn trong dung dịch HCl 5% (pH = 2). Loại tạp chất trong dịch acid

bằng dung dịch ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 100 – 150 ml. Kiềm hóa dịch nước

bằng dung dịch amoniac đặc tới pH = 10 – 11. Chiết 5 – 6 lần bằng cloroform,

mỗi lần 100 – 150 ml để lấy hết alcaloid (kiểm tra bằng thuốc thử Dragendorff).

™ Chiết nguội: 

Cân chính xác khoảng 70,00 g bột lá sen, làm  ẩm bằng NH4OH 10%.

Ngâm với ethanol 96o

(khoảng 500 ml) trong 3 ngày. Cất thu hồi cồn, hòa tan

cắn trong dung dịch HCl 5% (pH = 2). Loại tạp chất trong dịch acid bằng dung

dịch ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 100 – 150 ml. Kiềm hóa dịch nước bằng dung

dịch amoniac đặc tới pH = 10 – 11. Chiết 5 – 6 lần bằng cloroform, mỗi lần 100 –

150 ml để lấy hết alcaloid (kiểm tra bằng thuốc thử Dragendorff). Kết quả định

lượng alcaloid toàn phần trong dịch chiết trình bày ở Bảng 3.7. 

 

Bảng 3.7. Hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá Sen thu được bằng                  

hai phương pháp chiết

 Nhận xét: 

 – Phương pháp chiết nóng cho lượng alcaloid trong lá sen nhiều hơn so

với phương pháp chiết nguội. Vì vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết nóng

trong qui trình chiết xuất alcaloid toàn phần từ lá sen. 

 Từ kết quả khảo sát, và nâng khối lượng dược liệu lên 320 g, qui trình

chiết xuất alcaloid toàn phần từ lá Sen được xác định như sau: 

Qui trình chiết xuất alcaloid toàn phần từ lá cây Sen: 

 Cân khoảng 320 g bột dược liệu, làm ẩm bằng NH4OH 10%, thêm 2,5 lít

ethanol 96o  và chiết nóng bằng cách đun hồi lưu cách thủy trong 2 giờ. Gạn và

lọc lấy dịch lọc, rửa lại bã dược liệu bằng ethanol. Dịch chiết ethanol được cất

thu hồi ethanol dưới áp suất giảm ở 60oC. Hòa tan cắn bằng dung dịch HCl 5% 

(pH = 2). Tiến hành chiết (3 – 4 lần) đồng lượng dịch chiết acid với ether dầu hỏa

để loại tạp chất. Kiềm hóa dịch chiết acid bằng dung dịch amoniac đặc tới pH =

10 – 11. Chiết 5 – 6 lần đồng lượng bằng cloroform (đến khi dịch chiết nước cho

phản ứng âm tính với thuốc thử Dragendorff), thu được dịch chiết cloroform. Cất

dưới áp suất giảm để thu hồi dung môi cloroform, hòa tan cặn thu được bằng 50

ml methanol và chuyển ra cốc có mỏ, bay hơi tới cạn, sấy ở 60oC trong 3 giờ,

thu được 2,85 g alcaloid toàn phần. 

2. Phân lập Nuciferin từ alcaloid toàn phần của lá Sen

™ Khảo sát chọn hệ dung môi

 Tiến hành sắc kí lớp mỏng hỗn hợp alcaloid toàn phần thu được từ lá Sen

với các hệ dung môi sau: 

  (1)  Cloroform : aceton : NH4OH (4 : 1 : 0,1).

  (2) Cloroform : ethyl acetat (5 : 1).

  (3) n-Hexan : aceton : H2O (1 : 1 : 0,1)

  (4) Cloroform : methanol (10 : 1)

  (5) n-Hexan : aceton (5 : 1).

  (6) n-Hexan : aceton : NH4OH (4 : 1 : 0,1)

  (7) n-Hexan : aceton : NH4OH (3 : 1 : 0,1)

 Trong đó, hệ dung môi n-Hexan : aceton : NH4OH (3 : 1: 0,1) cho kết

quả tách tốt nhất nên được lựa chọn để tiến hành chạy sắc kí cột pha thuận phân

lập Nuceferin từ alcaloid toàn phần thu được.

™ Xây dựng qui trình phân lập Nuciferin từ alcoloid toàn phần của lá Sen:

  ▪ Chuẩn bị cột sắc kí: Dùng cột thủy tinh trung tính có đường kính 3 cm,

chiều dài 50 cm,  được lắp thẳng  đứng trên giá, phía dưới cột có van  để  điều

chỉnh tốc độ dung môi. Khóa van, cho một ít dung môi rửa giải vào cột. Lót một

lớp bông mỏng ở phía đáy cột, ngay trên van để chất nhồi sau khi được nhồi vào

cột không gây tắc cột.

  ▪ Nhồi cột: Cân 50 g chất nhồi cột silica gel 60 (0,04 – 0,063 mm), cho

vào cốc thủy tinh có chứa 300 ml cloroform, khuấy đều rồi đổ từ từ lên cột. Mở

khóa cột cho dung môi chảy từ từ để các hạt chất nhồi cột lắng xuống (có thể

dùng đũa thủy tinh có bọc cao su gõ nhẹ vào cột, để tăng nhanh quá trình lắng),

trong quá trình này luôn bổ sung dung môi lên cột, tránh để cột bị khô. Ổn định

cột trong khoảng 3 giờ và đến khi khoảng cách từ mặt trên lớp chất nhồi đến mặt

trên dung môi rửa giải còn khoảng 1 cm thì đóng khóa cột.

  ▪ Đưa mẫu lên cột: Hòa tan khoảng 2,85 g alcaloid toàn phần trong 10 ml

cloroform, thêm 5 g chất nhồi cột silica gel 60, trộn đều, cất thu hồi dung môi

được hỗn hợp bột tơi. Chuyển nhẹ nhàng vào cột, tránh xáo động lớp chất nhồi

trong cột, dùng pipet tráng vòng quanh bên trong cột trước khi thêm dung môi

rửa giải.

  ▪ Dùng hỗn hợp dung môi n-Hexan : aceton : NH3 đặc (3 : 1 : 0,1) để rửa

giải. Tốc độ rửa giải 2 ml/phút (khoảng 40 giọt/phút). Bỏ khoảng 75 ml dịch rửa

giải đầu tiên và lấy 100 ml dịch rửa giải tiếp theo, cất thu hồi dung môi được

cặn, sấy dưới áp suất giảm ở 60oC trong 4 giờ, sử dụng chất hút ẩm là phosphor

pentoxyd (P2O5) thu  được khoảng 2,1 g sản phẩm phân lập chứa hoạt chất

Nuciferin khoảng 96,2%. 

3. Tinh chế Nuciferin

 Tinh thể Nuciferin thu  được sau khi phân lập  được hòa tan trong một

lượng vừa đủ cloroform rồi chấm lên 3 bản mỏng silica gel tráng sẵn (Merck) và

được khai triển bằng 3 hệ dung môi khác nhau.

 Hệ I: n-Hexan : aceton : NH4OH (3 : 1 : 0,1).

 Hệ II:  Cloroform : methanol (10 : 1).

 Hệ III: Cloroform : ethyl acetat (5 : 1).

Phát hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff. Soi dưới đèn tử ngoại ở bước

sóng 254 nm. Với cả 3 hệ dung môi đều chỉ có một vết trên sắc kí đồ song song

với chuẩn liên kết chứng tỏ Nuciferin tinh chế được đã tinh khiết. Vì vậy, để đơn

giản qui trình tinh chế được lựa chọn là kết tinh lại nhiều lần trong cloroform

như sau: Hòa tan 2,1 g sản phẩm phân lập được ở trên trong 50 ml cloroform, để

yên 3 giờ trong ngăn mát tủ lạnh (nhiệt độ 2 – 8oC) để tăng khả năng kết tinh, lọc

lấy tinh thể. Kết tinh lại 3 lần, sấy trong tủ sấy chân không với phosphor

pentoxyd (P2O5) thu được 2,0 g sản phẩm Nuciferin tinh thể đạt độ tinh khiết 

98,23 – 99,08%.